游离胆固醇(FC)是构成细胞膜的主要成分，也是合成性激素、胆汁酸、维生素D和肾上腺皮质激素等物质的重要原料，FC浓度可作为脂代谢的指标。本试剂盒的检测方法是微量法，既可以用可见分光光度计检测，也可以用酶标仪检测。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-胆甾烯酮和H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，其在500 nm有吸收峰，颜色深浅与FC含量成正比。作用方式如下：

测定游离胆固醇(FC)请选择60724ES 游离胆固醇(FC)含量检测试剂盒;

测定总胆固醇(TC)请选择60723ES 总胆固醇(TC)含量检测试剂盒；

测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)请选择60736ES 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量检测试剂盒；

测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)请选择60737ES 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量检测试剂盒;

胆固醇检测4款相关产品如下：

组分信息

使用说明

【注意事项】实验之前建议选择3个预期差异大的样本做预实验，如果样本吸光值不在测量范围内，建议稀释或者增加样本量进行检测。

1.需自备的仪器和溶剂：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、EP管、蒸馏水和异丙醇。

2.溶液的配制：

1）自备提取液异丙醇：大约需要110 mL，常温保存；试剂盒内提供一个30 mL棕色空瓶，仅做分装使用。

2）标准品溶液的配置：10 mg胆固醇使用前加入517 μL提取液，振荡溶解后即为50 μmol/mL的胆固醇标准溶液，2～8℃可保存4周。

3）工作液的配制：根据样本量将试剂一：试剂二按 3 mL：20 μL（约16T）的比例配制工作液，现用现配。

3.操作步骤：

1）样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

a.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5～10 的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。10000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

^{b.细菌/细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500～1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300 w，超声2秒，间隔3秒，总时间3 min）；然后 10000 g，4℃离心10 min， 取上清置于冰上待测。}

c.血清（浆）等液体样本：直接测定，若有沉淀请离心后取上清待测。

2）测定步骤

a.可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至500 nm，分光光度计蒸馏水调零。

b.按需取出一定量的工作液，临用前37℃预热10 min以上。

c.将50 μmol/mL胆固醇标准品用提取液进行稀释得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μmol/mL的标准品备用。

备注：下述实验中每个标准管需20 µL标准品（注意不要在此步骤直接检测吸光度）。

d.在1.5 mL EP管/96孔板按下表步骤加样

4.总胆固醇含量计算：

a.根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

b.游离胆固醇的计算

（1）按血清（浆）等液体体积计算：FC含量（μmol/dL）=x×100×F

（2）按样本蛋白浓度计算：FC含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）×F =x÷Cpr×F

（3）按样本质量计算：FC含量（μmol/g 质量）=x×V提取÷W×F =x÷W×F

（4）按细胞/细菌数量计算：FC含量（μmol/10⁶ cell）=x×V提取÷N×F =x÷N×F

100：单位换算系数，1 dL=100 mL；V提取：加入样本的提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；N：细胞/细菌总数，以10⁶计；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；F：样本稀释倍数。

5.实验实例：

1）0.100g 小鼠肾脏加入1mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得ΔA测定=A测定-A空白=0.278-0.046=0.232，根据标准曲线 y = 0.3016x + 0.0028，R²= 0.9996，计 算 x=0.760，按样本质量计算含量得：

 FC含量（μmol/g质量）=x÷W×F =7.6 μmol/g质量。

2）取 10×10⁶个 Hela细胞加入0.5 mL提取液进行超声破碎，按照测定步骤操作，使用96孔板测得 ΔA测定=A 测定-A 空白=0.110-0.046=0.064，根据标准曲线 y = 0.3016x + 0.0028，R² = 0.9996，计算 x=0.203，按细胞数量计算含量得：

 FC含量（μmol/10⁶ cell）= x×V 提取÷N×F =0.0102 μmol/10⁶ cell。

3）取大鼠血清样本，直接按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA测定=A测定-A空白=0.155- 0.046=0.109，根据标准曲线 y = 0.3016x + 0.0028，R²= 0.9996，计算 x=0.352，按血清（浆）等液体体积计算含量得：

FC 含量（μmol/dL）=x×100×F=35.2 μmol/dL。

2～8℃保存，有效期6个月。